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一種新型細胞劃痕實驗方法的簡要介紹
點擊次數:7303 發布日期:2019-3-4  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
 
一.傳統細胞遷移實驗技術—劃痕實驗
1.基本原理
細胞劃痕(修復)法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上, 用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續培養細胞至實驗設定的時間(例如72h),取出細胞培養板,觀察周邊細胞是否生長(修復)至中央劃痕區,以此判斷細胞的生長遷移能力,實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過不同分組之間的細胞對于劃痕區的修復能力,可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。

 
實驗材料 細胞樣品
試劑、試劑盒 無血清培養基 PBS
儀器、耗材 6孔板 maker 直尺 槍頭
實驗步驟
  • 準備:
    所有能滅菌的器械都要滅菌,直尺和marker筆等在操作前,需紫外照射30min(超凈臺內)
  • 流程
1.先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻得劃橫線,大約每隔0.5-1cm一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。
2.在空中加入約5X105個細胞,具體數量因細胞不同而不同,掌握為過夜能鋪滿。
3.第二天用槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜。
4.用PBS洗細胞3次,去處劃下的細胞,加入無血清培養基。
5.放入37度5%CO2培養箱,培養。按0,6,12,24小時取樣,拍照。

2、操作步驟
(1)先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔0.5~1cm一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。 
(2)在孔中加入約5×105個細胞,具體數量因細胞種類不同而不同,接種原則為過夜后融合率達到100%。
(3)第二天用槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜(不同孔之間最好使用同一只槍頭)。
(4)PBS洗細胞3次,去處劃下的細胞,加入無血清培養基。
(5)放入37℃ 5% CO2培養箱,培養??砂?,6,12,24h時間點取樣,拍照(具體時間依實驗需要而定)。
(6)統計方法:使用Image J軟件打開圖片后,隨機劃取6至8條水平線,計算細胞間距離的均值。
 

3.注意事項:
(1)在用PBS緩沖液沖洗時,貼壁慢慢加入,以免沖散單層貼壁細胞,影響實驗拍照結果。
(2)一般做劃痕實驗,都是無血清或者低血清(<2%)否則細胞增殖就不能忽略。
(3)按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕,可以形成若干交叉點,作為固定的檢測點,以解決了前后觀察時位置不固定的問題。
二.傳統實驗方法主要問題
傳統實驗方法缺點是細胞增殖對實驗結果有影響,即使在無血清或低血清條件時,細胞的狀
態、代謝等方面會受到影響,由于細胞內信號傳導系統整體性的下調,細胞遷移的速度也會
慢很多;另外創建“傷口”也可能時大時小,邊緣不整齊等誤差;還有在鏡下拍照觀察時,
每次觀察點基本不可能做到完全一致等。
 
三.最新實驗解決方法-------傷口愈合劃痕插件
 



可黏附底部;生物相容硅膠材料;9 mm x 9 mm x 5 mm;兩孔(70μl/孔);每孔生長面積0.22 cm2;可產生500 μm寬的“gap”  

特點:
1. 在一定程度上模擬了體內細胞遷移的過程。
2. 非常適合研究細胞與胞外基質(ECM),細胞與細胞之間相互作用引起的細胞遷移。
3. 與包括活細胞成像在內的顯微鏡系統兼容,可用于分析細胞間的相互作用。
4. 研究細胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。
 
細胞培養插件方法與傳統劃痕實驗比較
細胞培養插件提供重復性更好的實驗結果:
左圖是傷口愈合插件做出的實驗數據統計;右圖是槍頭劃痕做出的實驗數據統計

四.方案小結
1) 新型細胞劃痕實驗方法可以保證劃痕的標準化,保證了實驗的重復性-對比槍頭劃痕,劃痕會歪歪扭扭,無法保證每次都一樣; 
(2)新型細胞劃痕實驗方法可以避免槍頭劃痕會傷到包被;手動劃痕傷到包被的話,會直接影響了細胞遷移的結果;
(3)直接鏡檢觀察,成像效果良好; 
(4)新型細胞劃痕實驗方法有配套的圖像分析,圖像分析是通過計算實驗區域的空白面積來計算愈合情況的,比分析計算的要更客觀準確;
(5)產品用法簡介: 只需要在插件的兩個孔里種細胞,等細胞貼壁了再拔掉這個插件,細胞之間就會留下一道標準的劃痕,就可以開始定時觀察細胞愈合的情況了;
(6)多種規格適合不同的實驗流程,2孔,3孔,4孔,帶培養皿或者插件,細胞追蹤實驗專用插件培養皿等
來源:廣州科適特科學儀器有限公司
聯系電話:020-38102730
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